直播答疑 | 原代細胞培養常見問題及解決方案

臍靜脈內皮細胞建議包被，建議選用0.1%明膠包被，包被的細胞形態會比不包被的好看。

角質細胞生長類似上皮細胞，營養環境要求高，建議使用膠原蛋白包被。

傳代后邊界不清晰，考慮細胞是否需要外基質條件，嘗試包被培養瓶；其次考慮細胞是否老化、分化。

真菌污染細胞，建議丟棄，避免對其他細胞造成交叉污染，損失更大；若要挽救，建議隔離培養，加兩性-霉素B等抗生素，每天換液，持續清除，但只能維持幾周，后續培養會反復爆發，耗費成本更高。

污染較輕的，不會影響細胞狀態，出現大量碎片，細胞內部也有碎片，污染就很嚴重了，支原體清除試劑對外部清除有效，內部較難清除；同時在細胞內部已損傷情況下，沒有必要清除，此時細胞已經喪失很多功能，建議廢棄。

肝細胞營養環境要求較高，建議包被，不包被影響貼壁率（低于50%），長時間培養不包被會導致細胞卷曲聚團，影響狀態。

原代細胞復蘇貼壁少，生長慢，首先是調整細胞密度保持在70%以上，確保生長狀態，其次選用高質量血清或培養基進行補救，也可以補加5%血清。

一般建議：

分離初期紅細胞較多，可用淋巴細胞分離液或Percoll分離液分離，也可用裂解液處理。

貼壁法細胞爬出慢，周期長，成功率不高耗費時間，得到的細胞活性相對高；消化法，速度快，數量多，剛分離的活性差一點，后期培養要適應，看自主需求選擇。

理論上無傳代次數限制，實際培養中，受離體培養環境變化、血清質量、培養基質量、傳代損傷等外部培養環境影響，細胞超過10代以上會出現分化、不增殖、老化凋亡等問題，所以常規建議10代以內使用。

骨骼肌衛星細胞，本身貼壁性不強，易漂浮，特別是局部密度大會導致細胞聚集成束，最后分化形成肌管束，建議培養中均勻接種，包被增強吸附性，控制密度在70-80%。

脂肪細胞原代培養沒分出細胞，一是要檢查分離方法是否正確，中間每一步操作最好進行鏡檢，可以找出是哪一步損失細胞的，二是考慮后面離心步驟是否損失細胞，細胞包含脂滴，密度較小，漂浮丟棄了也有可能。