細胞凍存與復蘇的技術原理和操作步驟

細胞凍存與細胞復蘇，是細胞培養過程中的常見工作。

細胞凍存，是指將細胞貯存在超低溫環境中，使細胞暫時“冬眠"的技術，在需要的時候再進行復蘇。

細胞復蘇，是把凍存在-80℃冰箱或液氮中的細胞快速解凍，并使細胞重新恢復生長的技術。

本文將為大家介紹細胞凍存與復蘇的技術要點和操作步驟。 

細胞凍存原則為“慢凍"，即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。

如果直接將細胞懸液放在超低溫下快速冷凍，細胞會受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。

DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中，延緩溫度下降速度，減少細胞內冰晶的形成，從而起到保護細胞的作用。

需注意的是，DMSO溶于培養基時，將釋放大量熱量，所以細胞凍存液需提前配制，不能直接將DMSO加入含有細胞的培養基中，避免燙傷細胞。

另外，DMSO屬于致癌物質，使用時應戴好手套，規范操作。

程序凍存液成分一般由基礎培養基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%，DMSO比例為5%~10%。根據普諾賽實驗室細胞培養經驗，推薦凍存液配比：55%基礎培養基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，難養細胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存。

細胞凍存和復蘇過程中，不可避免會損失部分細胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升細胞復蘇存活率，推薦密度為100~300萬細胞/mL。

使用程序降溫盒是最-常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇，有些則不需要。

降溫盒須恢復室溫后再使用。

根據普諾賽實驗室細胞培養經驗，使用程序凍存盒凍存效果良好，沒有凍存盒的同學可以參照下文方法二和方法三。

無血清非程序凍存液是一種商品化的凍存液，無需自己配制，無需降溫盒，大大提升了便捷性。

但是，并非所有細胞都適用于這種凍存液，使用前必須做凍存測試，沒問題后再批量應用。

▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖

在沒有凍存盒或者非程序凍存液時，可以選擇手動梯度降溫。但手動梯度降溫不適用于所有細胞，且效果不穩定，同樣需要先做凍存測試。

▲ 手動梯度降溫操作示意圖

細胞復蘇講究“快融"，越快融化，細胞所受損傷就越小。細胞復蘇的操作不復雜，但每一步都必須穩扎穩打，才能最大限度地提高復蘇存活率。

步驟1：水浴鍋預熱至37℃備用

步驟2：準備15mL離心管，并向其中加入適量培養基待用

步驟3：將細胞凍存管從-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴鍋

步驟4：用力搖晃凍存管，使其在1分鐘內融化

步驟5：用紙巾擦拭水漬，轉移至生物安全柜。用移液槍吸取細胞懸液，緩慢滴加到步驟2中準備好的離心管

步驟6：1200rpm離心3分鐘

步驟7：棄上清，用新鮮培養基重懸細胞，接種至新的無菌培養器皿中

▲ 細胞復蘇操作示意圖

做完步驟7，細胞就復蘇好了。復蘇的細胞需要一段時間恢復狀態，當復蘇后的細胞密度低于80%時，48小時內不要換液，待細胞形態、生長速度等恢復正常，再進行細胞傳代等操作。（不要因為復蘇后兩三天細胞狀態不好就丟棄，應耐心等待至少一周。）

當然，細胞復蘇后狀態很好的情況下，可以提前開始后續的細胞培養實驗。